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鑒定細胞死活的方法有哪些

活細胞的鑒定在生物學和醫(yī)學上具有很重要的意義。細胞培養(yǎng)過程中要隨時記錄細胞的生長情況，需要經(jīng)常測定細胞的存活率；在腫瘤細胞的研究中，為了檢驗各種藥物對腫瘤細胞的殺傷力，也需要測定腫瘤細胞的存活率。在臨床醫(yī)學中死活細胞的鑒定也有很大的應(yīng)用，例如為了檢測某一男子的生育能力，測定精子細胞的存活力是比較常用的辦法。

死活細胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細胞死活鑒定方法，簡便，易于操作。但是通過直接的形態(tài)觀察來鑒別細胞死活，實驗結(jié)果很容易受操作者的主觀因素的影響，存在一定的誤差，所以，在實際操作中也常采用一些儀器來進行的批量檢測。

不同的死活細胞鑒定方法有各自不同具體的反應(yīng)機理，但無論采用何種辦法，都是利用了死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異。

常用的方法包括染色法和儀器分析法。

1 染色法

染色法分化學染色法和熒光染色法，根據(jù)染色機理的不同，染料或使死細胞著色，或使活細胞著色。死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異主要包括：

死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過；而細胞死亡之后，細胞膜受損，通透性增加。常用的以臺盼藍鑒別細胞死活的方法就是利用了這一性質(zhì)。臺盼藍，又稱錐藍，是一種陰離子型染料，不能透過完整的細胞膜。所以經(jīng)臺盼藍染色后只能使死細胞著色，而活細胞不被著色。甲基藍有類似的染色機理。植物細胞的質(zhì)壁分離也可鑒定死活。

死活細胞在代謝上的差異：是采用美藍染料鑒定酵母細胞死活的依據(jù)。美藍是一種無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。由于活細胞中新陳代謝的作用，使細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化性變?yōu)闊o色的還原型，因此美藍染色后活的酵母細胞無色；而死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱，使美藍處于氧化態(tài)，從而被染成藍色或淡藍色。

熒光素雙醋酸酯（FDA）是一種常用的培養(yǎng)動植物細胞以及植物細胞原生質(zhì)體的生活力鑒定染料，其染色機理也利用了死活細胞在代謝上的差異：FDA本身不產(chǎn)生熒光，也無極性，能自由滲透出入完整的細胞膜。當FDA進入活細胞后，被細胞內(nèi)的脂酶分解，生成有極性的、能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)——熒光素，該物質(zhì)不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞膜內(nèi)，因而使有活力的細胞產(chǎn)生綠色熒光；而無活力的細胞因不能使FDA分解，而無法產(chǎn)生熒光。

除此之外，還有一些細胞器的專有染料。如液泡系的專有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細胞液泡著紅色，而細胞質(zhì)和細胞核不被著色；死細胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個細胞中，細胞核和細胞質(zhì)被染成紅色。有時侯為了增加染色效果可以將兩種染料結(jié)合使用，如甲基藍-中性紅混合染色法。

2 儀器分析法

可采用微電極技術(shù)（利用死活細胞膜兩側(cè)電位的差異）、全自動分析細胞記數(shù)儀和流式細胞儀等，可對細胞的死活進行的批量檢測。

德國INNOVATIS出產(chǎn)的全自動Cedex細胞存活率/細胞計數(shù)儀/細胞分析儀是 世界上*臺高分辨率、高清晰度掃描（）細胞分析儀，具有全自動臺盼藍染色、顯微CCD成象、CEDEX工作站軟件，可用于制藥、醫(yī)學、發(fā)酵、免疫、 病理、毒性測試、生物技術(shù)等學科的研究開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)過程中的細胞計數(shù)和分析。自動分析結(jié)果，檢測分析數(shù)據(jù)輸出（11項）：總細胞數(shù)目，總細胞濃度 （cells/mL） ；活細胞數(shù)目，活細胞濃度 （cells/mL）；死細胞數(shù)目，死細胞濃度 （cells/mL） ；細胞存活率 （%） ；細胞的平均圓度 （compactness） ；細胞的平均直徑 （um） ；細胞團比例 （Aggregate Rate）；細胞直徑分布圖 （Diameter Histogram）；細胞團分布圖 （Aggregate Histogram）；細胞圓度分布圖 （Compactness Histogram） ；細胞生長時間曲線（C*tion Time Chart）。

流式細胞儀法 用來判斷細胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細胞膜進入細胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)，例如FDA可被活細胞持留而發(fā)出黃綠色熒光，若細胞有損傷 則會從細胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細胞膜，但能對固定的細胞及膜有破損的細胞的核進行染色，例如碘化丙啶（ PI,Propidium iodide ）和溴化乙錠（ EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二類熒光探針。碘化丙啶（PI）不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪 失，碘化丙啶（PI）可以染色壞死細胞。目前常用的一種細胞凋亡與壞死檢測試劑盒則含有Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）兩種熒光染料。細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮，Hoechst 33342可以穿透細胞膜，染色后凋亡細胞熒光會比正常細胞明顯增強。上述兩種染料雙染后，使用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測時，正常細胞為弱紅色熒光＋弱 藍色熒光，凋亡細胞為弱紅色熒光＋強藍色熒光，壞死細胞為強紅色熒光＋強藍色熒光。