細胞凋亡事件發(fā)生時,會出現(xiàn)蛋白質(zhì)和核酸分子結(jié)構(gòu)的改變,形成新的表位。利用免疫學(xué)方法對這些表位進行鑒定,有助于判斷樣本中細胞凋亡事件的發(fā)生。
細胞凋亡的發(fā)生,是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,這種鈣和鎂依賴性核酸酶容易進入的核小體間區(qū)解開雙鏈DNA,產(chǎn)生單/低聚核小體片段,而核小體本身由于DNA與組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解。采用雙抗體夾心酶免疫法,應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體,與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu),可特異性檢測細胞溶解物中的單/低聚核小體,從而判斷細胞是否發(fā)生凋亡。
【材料與試劑】
(1) 生物素標(biāo)記的小鼠抗-組蛋白單克隆抗體;
(2) 過氧化物酶(-POD)標(biāo)記的小鼠抗DNA單克隆抗體;
(3) 鏈霉親合素包被的微孔板;
(4) DNA-組蛋白復(fù)合物,作為陽性對照;
(5) ABTS底物;
(6) 溶解緩沖液;
(7) 溫育緩沖液;
底物緩沖液;
培養(yǎng)細胞或離體細胞的裂解物(細胞裂解步驟:收集細胞,離心后,用200μl溶細胞緩沖液重新懸浮,室溫下作用30min);
培養(yǎng)細胞的上清液;
血漿(血清);
分光光度計
【操作步驟】
(1) 取樣品離心后(1000r/min, 10min),吸取20μl上清液,加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中;
(2) 另加入80μl免疫反應(yīng)試劑:含抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物素及溫育緩沖液(按1:1:18混合),室溫下孵育2h(置搖床上,250r/min);
(3) 棄上清,用300μl溫育緩沖液洗滌3次,小心移去洗滌液;
(4) 加入100μl底物緩沖液,室溫下孵育至顏色變化至適合(置平板搖床上);
【結(jié)果判斷】
盡快作比色分析(10~20min內(nèi)),用底物緩沖液作空白對照,檢測波長405nm,參考波長492nm。
聚集值 = 樣品的mU(誘導(dǎo)凋亡處理的細胞) × 100
對照的mU(未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理的細胞)
注:mU=吸收值(10-3)=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值,若樣品的吸收值超過比色測定范圍,應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測。
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