此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)(450nm)測(cè)讀吸光值。酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀,通常指于測(cè)讀ELISA試劑盒研發(fā)結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有:測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可到0.001,準(zhǔn)確性為±1%,重復(fù)性達(dá)0.5%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下,操作時(shí)室溫宜在15~30℃,使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘,測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。
測(cè)讀A 值時(shí),要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,如OPD 用492nm 波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀,即每孔先后測(cè)讀兩次,*次在zui適波長(zhǎng)(W1),第二次在不敏感波長(zhǎng)(W2),兩次測(cè)定間不 移動(dòng)ELISA試劑盒研發(fā)板的位置,zui終測(cè)得的A 值為兩者之差(W1-W2)。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán),也含親水基團(tuán),其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合,從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用,使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在0.05%-0.2%之間,高于0.2%時(shí),可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)。
洗板時(shí)注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋,應(yīng)按要求稀釋,所用的水電導(dǎo)率在1.5us/cm 之下,洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時(shí)間為40 秒左右,孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好,手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。
洗滌在ELISA試劑盒研發(fā)過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELISA試劑盒研發(fā)就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)??梢哉f(shuō)在ELISA試劑盒研發(fā)操作中,洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)引起操作者的高度重視,操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌,不得馬虎。
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